0571-5609-0805

SCI英文润色_SCI论文发表_科研实验外包_杭州立效生物

扫一扫关注微信公众号

在线客服
电话客服
0571-5609-0805
客服组:
在线客服
服务时间:
0:00 - 24:00

版权所有©杭州立效生物医药科技有限公司    浙ICP备16004347号-1   XML地图

>
学习资源
>
流式细胞术实验(流式细胞术实验原理)

流式细胞术实验(流式细胞术实验原理)

一、流式细胞术简介

1、概念。流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)是一种能够同时检测、分析单个微粒(细胞、微生物及人工合成的微球)的多项物理及生物学特性,并加以定量的技术,同时可以对特定群体加以分选。

2、FCM的特点。(1)快速:最快可在1秒钟内计测数万个细胞;(2)可进行多参数测量:可以对同一个细胞做有关物理、化学特性的多参数测量,并具有明显的统计学意义;(3)一门综合性的高科技方法:它综合了激光技术、计算机技术、流动力学、细胞化学、图像技术等多领域的知识和成果;既是细胞分析技术,又是精确的分选技术。

3、流式细胞术的原理。让荧光染色的细胞在稳定的液流推动装置作用下,通过直径为50-100μm的小孔并排列成单行,每个细胞依次而且恒速通过激光束的照射区,细胞受激光照射后产生散射光和荧光。通过检测散射光可知细胞的体积和胞内颗粒物,检测荧光可知细胞被荧光素所标记物质的含量。根据所规定的参量可把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来,以便进一步的研究分析。

4、流式细胞仪分析的参数。(1)前向角散射(forward scatter,FSC):强度与细胞的大小有关,即FSC强,细胞大,FSC弱,则细胞小。(2)侧向角散射(side scatter,SSC):又称90°散射或大角散射。与细胞膜、细胞质、核膜的折光率,以及胞内颗粒的大小有关。因此,侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。(3)荧光强度(fluorescence intensity,FL):通过荧光强度可以将同一个细胞群体中的阳性细胞(荧光标记)与阴性细胞(无荧光标记)区分开来,也可以将强阳性细胞(高FL)与弱阳性细胞(低FL)区分开来。(4)同时分析多种荧光标记:细胞上的荧光染料被激光激发后发射出荧光,不同的荧光染料发射波长不同。大型的流式细胞仪装有三个激光光源(488nm、633nm和407nm),可同时检测13种荧光。

5、流式细胞术的应用。(1)科研中的应用:检测细胞周期、检测细胞凋亡、检测细胞增殖、检测细胞吞噬功能、干细胞研究、检测基因表达等。(2)临床应用:免疫细胞亚群检测、检测细胞因子、白血病和淋巴瘤的免疫分型、血小板分析等。

二、流式细胞术在评价免疫功能中的应用

1、外周血淋巴细胞亚群分析

(1)外周血白细胞分类。

(2)外周血淋巴细胞亚群分类及功能。根据功能,淋巴细胞主要分为T淋巴细胞(与细胞免疫有关)、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、B淋巴细胞(与体液免疫有关)、NK细胞(能够直接杀伤某些肿瘤细胞和病毒感染的细胞)。

(3)外周血淋巴细胞亚群流式分析。

(4)淋巴细胞亚群的临床应用。通过淋巴细胞亚群的检测可了解在不同情况下体内免疫功能状态,辅助临床疾病的诊断,探索疾病发病机理、病程、预后,监测、指导临床治疗方案。

(5)T和B淋巴细胞的临床意义。T淋巴细胞上升多见于慢性活动性肝炎或慢性迁延性肝炎、器官移植排斥反应、重症肌无力、甲亢与甲状腺炎患者。T淋巴细胞下降多见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎)、原发性免疫缺陷病(如生天性胸腺发育不全、艾滋病)、接受放疗、化疗或者使用肾上腺皮质激素等免疫抑制剂。B淋巴细胞上升多见于多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淋巴瘤、艾滋病。B淋巴细胞下降多见于原发性免疫缺陷病、如性联无丙种球蛋白血症等、恶性肿瘤。T淋巴细胞与B淋巴细胞同时下降多见于联合免疫缺陷病、如重症状联合免疫缺陷病等。

(6)Th/Ts比值的临床意义。CD4+/CD8+的比值:评价自身免疫失调或被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态,此外,这一比值还可用来监测骨髓移植病人,以免受到急性GVHD的攻击。CD4/CD8升高:自身免疫性疾病,如类风湿性关节炎、SLE。CD4/CD8 降低:病毒感染、恶性肿瘤、再生障碍性贫血等。

(7)自然杀伤细胞(NK)的临床意义。NK细胞增高常见于某些病毒感染性疾病的早期、长期使用干扰素或使用干扰素的诱导物、骨髓移植后、习惯性流产。NK细胞降低常见于恶性肿瘤,特别是中晚期或伴有转移的肿瘤、免疫缺陷病及使用肾上腺激素等免疫抑制剂、部分病毒感染、细菌感染及真菌感染、某些白血病及白血病前期。

2、外周血Th1、Th2、Th17和Treg细胞分析

(1)Th细胞分化及功能。辅助性T细胞是T淋巴细胞的一个亚群,当受到不同的协同刺激和细胞因子信号时,辅助性T细胞会分化成Th1、Th2、Th9、Th17、Tfh、Treg等细胞。分化的Th细胞亚群会分泌不同的细胞因子,行使不同的功能。

(2)Th1、Th2、Th17检测原理。(a)活化:自然状态下,静止的淋巴细胞不分泌或者分泌极少量细胞因子,刺激激活后,细胞内的细胞因子合成增加。常用的刺激剂有佛波酯PMA、离子霉素(Inomycin)、ConA、PHA、LPS等。(b)抑制分泌:细胞因子合成后很快就主动分泌到细胞外,位于细胞内的细胞因子的量很少,一般无法达到流式分析检测的最低标准,因此必须阻止细胞因子分泌到细胞外。蛋白质分泌抑制剂如莫能霉素(monensin)、BFA(brefeldin A)能抑制细胞因子分泌,使其累积在细胞内。(c)标志物:IFN-γ、IL-4、IL-17A分别为Th1、Th2、Th17的特征性细胞因子,同时标记CD4分子。

(2)Treg细胞的检测原理。CD4+ CD25+ Foxp3+是Treg细胞的表面标志。

(3)Th1、Th2、Th17、Treg临床意义。(a)Th1细胞主要介导细胞免疫应答,通过募集并活化巨噬细胞而引发迟发型超敏反应性炎症;Th2细胞可辅助B细胞产生不同类别抗体,主要介导体液免疫应答;Th17主要介导炎症反应;Treg是一类具有免疫抑制作用的T细胞,不仅参与自身免疫耐受调节,而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。(b)Th亚群细胞因子平衡对人体正常生理功能的维持发挥重要作用,细胞因子分泌失调会导致各种疾病的发生,将细胞因子调节到平衡状态是治疗这些疾病的重要手段。

解放军306医院特种医学实验研究中心自2003年开始,采用流式细胞术开展了外周血淋巴细胞亚群检测,随后开展了Th1、Th2、Th17、Treg的检测,至目前为止已出具数万份检测报告,为评估患者的免疫功能,判断患者病情,辅助临床医生制定治疗方案均提供了重要的依据。