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每个研究人员都应该知道的 11 篇 qPCR 论文

每个研究人员都应该知道的 11 篇 qPCR 论文

无论您是基因组学初学者还是经验丰富的诊断专家,迟早您都需要了解有关定量 PCR (qPCR) 的知识。也称为实时 PCR,您不能在不接触 qPCR 数据的情况下在基因组学出版物上大打出手。

因此,您可能正在设计实验或查看数据;无论哪种方式,当有人说 C t value时,您应该熟悉 qPCR 论文!

为什么?因为要正确执行 qPCR 并解释数据,您需要了解它是否真的显示差异基因表达,实验是否符合发布定量实时 PCR 实验 (MIQE) 指南的最低限度信息,或者您是否有有效的标准曲线。

你说什么是C t值?不要绝望!我们重点介绍了最热门的 qPCR 文献,它们是您成为 qPCR 专业人士的途径。如果您已经是专业人士,那么评论永远不会受到伤害!

qPCR 最佳实践文献

设计一个成功的 qPCR 确实需要一些仔细的规划和优化。本节中的 qPCR 文献列出了包含创建稳健检测的最佳实践的出版物。

1.发布定量实时荧光定量 PCR 实验 (MIQE) 的最少信息

这篇由 Stephen Bustin 及其同事在 2009 年撰写的论文 [1] 已成为标准化 qPCR 实验的首选指南。因此,它在 qPCR 文献列表中排名第一!

MIQE 旨在比较来自不同实验室的 qPCR 结果,并允许其他人复制已发表的实验。通常,研究人员可能会忽略引物和探针序列、反应条件或对市售试剂盒进行的任何修改等细节。阅读我们关于 MIQE 指南的文章,了解本文的更详细摘要。

MIQE 指南不仅提供关于 qPCR 检测的发布规则,还可以作为开发检测的清单。例如,抑制测试被列为基本信息。这会迫使研究人员(您)执行该测试,甚至可能会提示您包括内部控制,如果您没有考虑包括一个。

在移取一滴之前,请阅读本文!

2. 终极 qPCR 实验:首次产生出版质量、可重复的数据。

在这篇生物技术评论趋势中,Taylor等人。讨论使 qPCR 稳健的技术以及不同实验和研究组之间的数据可比性。[2]

对于分析开发人员来说,这篇评论是一个很好的起点,也是一个方便的参考。作者还谈到了 MIQE 指南、分析设计和潜在的错误来源。

作者提供了对检测设计、开发和质量控制的全面描述,这意味着您可以在设计 qPCR 检测时将此评论用作清单。本文强调的一些基本考虑因素包括:

由于将核酸提取物的等分试样移液作为输入到 qPCR 中而导致的二次采样错误。

实验的质量控制,包括监测 PCR 抑制的内部控制。

评估端到端程序的重要性,包括生物样本的一致和正确存储和处理。

多重考虑,例如单管中的染料兼容性和引物的脱靶扩增。

还有更多!这篇评论非常值得一读。

3. 使用实时 RT-PCR 对 mRNA 进行定量

诺兰等人。[3] 提供必要的 qPCR 阅读及其对 qPCR 实验规划的简明摘要。论文中的流程图提供了极好的快速参考指南。

作者在规划 qPCR 实验时强调了各种步骤和选项。

样品类型注意事项。样本是临床样本还是细胞系?您是否需要对福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 切片进行激光捕获显微切割 (LCM) 等后续富集?

选择提取 mRNA与总 RNA,甚至使用粗裂解物。

使用安捷伦生物分析仪等方法测量 RNA 的质量,并选择您的 RT 引发策略和酶。

反应形式也很重要,您需要决定 RT 和 qPCR 的两步(即单独的试管)以及是否使用探针或嵌入染料。

您的 qPCR 的最佳条件需要通过实验确定,但在此步骤中所付出的努力从长远来看是有回报的。

在 qPCR 中选择和使用管家基因

我们之前已经介绍过如何选择正确的看家基因,但这是 qPCR 数据标准化的关键步骤,我们在下面重点介绍的不是一篇而是两篇关键论文。

4. 使用不合适的参考基因进行实时逆转录 PCR 数据标准化的影响

测量基因表达的一种方法是将与您感兴趣的基因相对应的 mRNA 量与“管家”基因的量进行比较。管家基因这个术语有点用词不当,因为所谓的管家基因的表达水平确实有所不同,并且会受到不同实验条件或治疗的影响。[4]

当然,这可能会影响量化的准确性。因此,管家基因的验证至关重要。

德达等人。[5] 提供了一个案例研究,比较了TLR2基因在针对不同管家基因进行标准化时的基因表达。本文是您自己的验证实验的绝佳指南。

5. 通过多个内控基因的几何平均对实时定量 RT-PCR 数据进行准确归一化

在选择管家基因进行标准化时,您应该考虑来源组织或细胞系。幸运的是,Vandesompele等人。[6] 提供了一种全面的方法来表征来自不同组织类型的不同管家基因。

谁说你只需要选择一个?作者建议至少使用三个来标准化您的 RT-qPCR 结果。

您可以使用本出版物帮助您选择看家基因进行标准化或验证您自己选择的看家基因

关于量化的 qPCR 论文

本节介绍如何确保您的 qPCR 是定量的,因为这与您如何设计和优化您的检测一样重要。

6. 使用实时定量 PCR 和 2 (-Delta Delta C(T)) 方法分析相关基因表达数据

基因表达的测量是 qPCR 的主要应用之一。在这种情况下,您将添加一个逆转录步骤来创建 cDNA (RT-qPCR)。

Livak 和 Schmittgen [7] 描述了一种相对定量策略,该策略比较了为您的检测目标获得的Ct值和为内部对照基因(也称为管家基因)(如 GAPDH)获得的 Ct 值。

有两个重要的警告:

您只能用相对术语(如倍数变化)来表达您的数据,而不能用绝对术语(如副本/反应)来表达。

在将其用作校准物之前,您应该描述您的实验处理如何影响您的对照基因。如果它不保持在恒定的表达水平,那就不好了。

该论文描述了如何推导 2 –ΔΔCt方程,并提供了比较目标基因和内部对照基因的 Ct 值的示例数据。如果您打算使用 2 –ΔΔCt方法进行定量,这是一个很好的操作指南,用于处理数字甚至设置您的重复反应。

您可以在此处获取有关双增量 Ct 分析的更多信息

7. 一种新的实时 RT-PCR 相对定量数学模型

Michael Pfaffl 的这篇文章在计算基因表达方面更进了一步。[8]

如上所述,看家基因可能会受到不同实验条件的影响,因此必须预先对其进行验证。针对不同目标的 PCR 引物可以以不同的效率放大它们。

因此,确定目标基因和管家基因引物的 PCR 效率至关重要。使用等式 [Equation] [-1/slope]很容易做到这一点。

一旦获得了扩增效率,您就可以通过取目标基因和管家基因的变化与交叉点 (Cp) 值(Cp 值只是 C t值的另一个名称)的比率来计算相对基因表达。

该论文还研究了 cDNA 输入量对 PCR 效率和定量准确性的影响。

在您的目标和经过验证的看家基因上使用这些计算将有助于为您提供可靠且可重复的数据。

8. 定量实时 PCR 分析中质粒 DNA 构象引起的定量偏差

使用标准曲线进行定量是分子生物学 101,如果您不熟悉构建用于 qPCR 实验的标准曲线,请阅读我们关于The Obligate qPCR Standard Curve的文章。

许多人使用质粒或克隆扩增子作为他们的标准,但可能会让您感到惊讶的一件事是超螺旋质粒 与. 线性化或有切口的质粒可以产生不同的 C t值!

完全由超螺旋物质组成的质粒制剂由于冻融循环和移液剪切而变得松弛。这会导致结果不一致。

如何测量质粒标准品的浓度也很重要。无论是通过紫外吸光度还是荧光 DNA 结合染料,在测量标准品浓度时,一致性至关重要。

使用超螺旋或松弛质粒作为 qPCR 标准没有对错。您只想在工作中坚持相同的方法。

您可能决定完全线性化您的质粒标准品以消除多个超螺旋和松弛物种,但无论您采用何种方法,请务必包含详细信息,包括您如何在方案或出版物中分离和量化质粒。这可确保符合 MIQE 标准并使其他人能够重现您的结果。

林等人。[9] 做了一项广泛的工作,比较了测量质粒浓度的不同方法以及超螺旋与. 松弛质粒会影响使用各种 qPCR 格式(例如SYBR、MGB 探针等)获得的 C t值。

如果您计划运行质粒标准品,请在开发您的 qPCR 方案之前阅读本文。

9. 定量 PCR 的统计学意义

Karlen等人的这篇论文。[10] 不仅提供了量化 qPCR 目标的方法,还比较了不同方法的稳健性、准确性和精密度。正如您将从本文中看到的那样,有几种不同的方法可以分析您的 qPCR 数据。正如您可以针对不同的实验应用定制实验方法一样,您也可以针对不同的应用定制分析方法。

该研究在使用几种不同模型分析数据方面做得非常出色。作者引用了三种方法作为突出的方法,并为筛选型实验的最佳选择提供了指导,而不是针对不同样本类型的纵向实验。

qPCR 软件

数据分析或分析设计——有软件可以提供帮助!本节介绍用于分析数据和帮助设计检测的软件的 qPCR 文献。

10. qBase相对定量框架及实时定量PCR数据管理及自动化分析软件

海勒曼斯等人。[11] 描述了用于为称为 qBase 的分析软件提供动力的算法和计算。该软件使最终用户能够分析大型 qPCR 数据集并比较实验结果。

qBase 可以评估标准化并计算相对基因表达。它还可以比较运行之间的结果。

这篇论文发表时,qBase 是免费的,但现在似乎只能在此处以付费版本的形式获得。但是,提供了免费试用版,因此尝试它没有害处!

如果您正在考虑上述相对量化方法,那么 qBase 将是一个很好的自动化解决方案,因为算法是基于它们的。

11. 优化 PCR 设计的物理原理和视觉 OMP 软件

SantaLucia [12] 的这份出版物是必不可少的 qPCR 阅读,即使您不使用该软件。

所谓的视觉 OMP(寡核苷酸建模平台)的基础是反应动力学。换句话说,好的老式生物化学!

对于每个 qPCR,您都有引物、探针、酶和模板 DNA 以及其他因素。

还要考虑您的引物可能形成发夹或作为引物二聚体相互结合。对于多个目标的引物/探针组的多重反应,它变得更加复杂。

最后,引物和探针的杂交可能会受到错配的影响,错配的确切位置非常重要。

引物和模板之间的 5' 错配可能不是什么大问题,但在 3' 末端添加错配可能会阻止扩增。那么寡核苷酸中间的错配呢?

您可以通过创建自己的比对和经验性测试寡核苷酸来处理这些问题,但这可能很费力并且很快就会变得昂贵。

Visual-OMP 可以帮助您对这些相互作用进行建模,并且在设计复杂的 qPCR 和具有显着遗传变异性的靶向序列时是一种有价值的工具。

好的数据来自可靠的分析!