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CeRNA机制研究

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  ceRNA调控分析

  为了探讨circCCDC9、miR-6792-3p、CAV1三者之间的关系,研究人员做了一系列的验证实验。

  1)调控分析:分别敲减/过表达circCCDC9,检测CAV1的mRNA和蛋白水平变化情况,随后干扰/过表达miR-6792-3p,检测CAV1变化(这一步主要是分析细胞中三者之间的表达情况)。

  2)亚细胞定位:FISH实验检测circCCDC9和miR-6792-3p的亚细胞定位(“目标circRNA确定部分”对circRNA进行了亚细胞定位,这里同时对circRNA和miRNA进行亚细胞定位,已确定circRNA可以行使ceRNA调控功能)。

  3)结合关系分析:荧光素酶报告实验、RIP、RNA pull-down验证circCCDC9和miR-6792-3p的结合关系(多层次验证circRNA和miRNA的结合关系,部分文章会直接放在“目标miRNA确定”这一部分)。

  4)表达量分析:qRT-PCR检测胃癌组织中三者的表达情况,结果显示circCCDC9 和 CAV1表达正相关,circCCDC9和miR-6792-3p表达负相关,miR-6792-3p 和CAV1表达负相关(组织中进一步确定三者表达相关性)。

  5)功能回复:敲减/过表达circCCDC9后细胞表型的变化会在miR-6792-3p inhibitor/mimics处理后逆转(功能回复实验进一步证明circRNA和miRNA之间存在拮抗作用)。

  (5)体内实验

  1)肿瘤变化:circCCDC9过表达载体皮下注射入裸鼠体内构建异种移植瘤小鼠模型,每7天测量小鼠肿瘤体积,28天后测量肿瘤重量,结果显示过表达circCCDC9,显著减小肿瘤体积和重量(体内实验即动物实验一般是少不了的)。

  2)表达量变化:qRT-PCR和WB检测小鼠肿瘤组织中CAV1表达情况,IHC检测CAV1、E-cadherin表达上调,β- catenin、cyclin D1、Ki-67表达情况(除了目标mRNA,一般会再检测一些其他肿瘤相关基因的表达情况)。

  3)转移分析:静脉注射circCCDC9过表达载体构建肝转移小鼠模型,结果显示过表达circCCDC9的小鼠肝转移程度更低(这一部分可以归属于扩展研究)。

  4. 总结

  ceRNA机制理论上很简单,circRNA/lncRNA通过调控miRNA,进而调控mRNA的表达,但实际上要讲清楚三者之间的关系,大量的验证实验是必不可少的,多角度多层次去验证,当然验证的方法有很多种,需要一种或多种方法结合来验证,需要视具体情况而定,希望此文能为正在做或即将做ceRNA机制研究的老师提供一些思路。

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